吕春华等.高效液相色谱法测定氧化型染发剂中11种染料.《理化检验(化学分册)》.2012,第48卷(第11期),

　　孙宝佳等.艾曲波帕.《中国药物化学杂志》.2009,第19卷(第3期),

　　本发明名称为艾曲波帕中间体Ⅰ有关物质的检测方法,属于药物分析技术领域。本发明分别采取了以苯基和十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,以磷酸盐缓冲液和乙腈或磷酸乙腈溶液为流动相,采用梯度洗脱方式,所建立的2种高效液相分析方法能够分别有效测定艾曲波帕合成中间体Ⅰ2‑羟基‑3‑氨基‑联二苯‑3‑羧酸和中间体Ⅱ2‑(3,4‑二甲基‑苯基)‑5‑甲基‑2,4‑二氢‑吡唑‑3‑酮及上述中间体相关杂质的含量,方法专属性好、灵敏度较高、操作便捷,为艾曲波帕终产品的质量控制提供了有效保障。本发明还公开

　　1.一种高效液相色谱法分析测定艾曲波帕中间体I的相关杂质含量的方法,所述中间体I是2‑羟基‑3‑氨基‑联二苯‑3‑羧酸,其特征是,采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,以磷酸盐缓冲液为流动相A,磷酸乙腈溶液为流动相B,采用梯度洗脱方式,其中,

　　作为流动相A的所述磷酸盐缓冲液的pH值为3.5,磷酸盐缓冲液是浓度为5,15mmol/L的磷酸二氢钠或磷酸氢二钠水溶液,作为流动相B的所述磷酸乙腈溶液中,磷酸在乙腈中的体积分数为0.1,,

　　流动相的流速为1.2ml/min,色谱柱的柱温为50℃,检测波长为230nm,进样体积为10μl。

　　2.根据权利要求1所述的分析方法,作为流动相A的所述磷酸盐缓冲液是浓度为8,12mmol/L的磷酸二氢钠或磷酸氢二钠水溶液。

　　3.根据权利要求1所述的分析方法,作为流动相A的所述磷酸盐缓冲液是浓度为10mmol/L的磷酸二氢钠或磷酸氢二钠水溶液。

　　[0001]本发明属于药物分析技术领域,具体涉及一种测定用于合成艾曲波帕的中间体Ⅰ2‑羟基‑3‑氨基‑联二苯‑3‑羧酸和中间体Ⅱ2‑(3,4‑二甲基‑苯基)‑5‑甲基‑2,4‑二氢‑吡唑‑3‑酮相关杂质的含量的药物分析方法。

　　[0002]本发明还涉及用于艾曲波帕中间体II的分析方法中的一种新的杂质对照品化合物DH。

　　[0005]艾曲波帕是口服血小板生成因子类药物,该化合物可与跨膜区的血小板生成素受体相互作用,产生信号级联放大作用,进而诱导骨髓巨核细胞的增殖与分化。艾曲波帕由葛兰素史克公司率先开发,于2008年11月获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准在美国的上市,商品名为Promacta,用来医治糖皮质激素类药物、免疫球蛋白治疗无效或脾切除术后慢性特发性血小板减少性紫癜患者的血小板减少,是疗效显著的小分子血小板生成素受体激动剂。

　　[0006]艾曲波帕的合成路线等诸多文献中均有报道。尽管工艺参数不一样,但合成路线‑(3,4‑二甲基‑苯基)‑5‑甲基‑2,4‑二氢‑吡唑‑3‑酮(中间体Ⅱ)和两个中间体之间的缩合偶联反应进行制备。

　　[0008]中间体质量控制对于反应监测和收率提高有着及其重要的作用,同时也影响着终产品的质量。目前为止,相关文献和专利均无艾曲波帕中间体分析方法的报道,而全面系统地从起始原料到终产品特别是对合成过程中的关键中间体进行质量控制,对于艾曲波帕的质量研究与合成工艺的改进具备极其重大的指导意义。

　　[0009] 根据艾曲波帕中间体Ⅰ和中间体Ⅱ合成路线,其在制备及贮藏过程中能够产生的杂质包括原材料、中间产物以及位置异构体、脱甲基产物、二聚体等副产物。为完善中间过程控制,有效分析药品质量,保证用药安全,需要开发出一种便捷、有效检测艾曲波帕中间体有关物质的分析方法。

　　[0010] 本发明第一方面提供一种高效液相色谱法分析测定艾曲波帕中间体Ⅰ即2 ‑羟基‑3 ‑氨基‑联二苯‑3‑羧酸相关杂质含量的方法。

　　[001 1] 通过对中间体Ⅰ及其已知杂质的结构分析,针对化合物分子量普遍较小、均具备苯环结构、存在位置异构等情况,首先选择具有空间位阻特性且对于芳香族化合物具有独特的保留效果的苯基硅烷键合硅胶为填充剂。另外,根据化合物官能团解离特点,采用pH值为

　　3.0,4.0的磷酸盐缓冲液为流动相A,磷酸乙腈溶液为流动相B,在梯度变化过程中改变流动相体系的pH值,使同时具备氨基和羧基的杂质均能呈现出良好的色谱保留行为和分离效果。

　　[0014] 供试品溶液,取本品适量,加甲醇溶解并稀释制成每1ml甲醇溶液中约含0.2mg中间体I的溶液,作为供试品溶液。

　　[0015] 系统适用性溶液,取中间体Ⅰ、杂质AL、杂质BL、杂质CL、杂质SQ、杂质YW、杂质BD、杂质LS、杂质QA各适量,精密称定,用甲醇溶解并稀释制成每1ml甲醇溶液中约含中间体Ⅰ及各杂质分别为0.02mg的混合溶液。各杂质的结构如表1所示,

　　[0020] 色谱柱,采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,色谱柱粒径为5μm,色谱柱长度为250mm,色谱柱内径为4.6mm。

　　[0031] 供试品溶液色谱图中的杂质峰,按照按面积归一化法计算中间体Ⅰ中各已知杂质和未知杂质的含量。

　　[0032] 本发明第二方面提供一种高效液相色谱法分析测定艾曲波帕中间体Ⅱ即2‑ (3,4‑二甲基‑苯基) ‑5‑甲基‑2,4‑二氢‑吡唑‑3‑酮相关杂质含量的方法。具体地,本发明的上述方法可按照如下方式实现,

　　[0034] 供试品溶液,取本品适量,加甲醇超声溶解并稀释制成每1ml甲醇溶液中约含

　　[0035] 系统适用性溶液,取中间体Ⅱ、杂质SM1、杂质FJ、杂质DH各适量,精密称定,用甲醇溶解并稀释制成每1ml甲醇溶液中约含中间体Ⅰ及各杂质分别为0.05mg的混合溶液。各杂质的结构如表2所示,

　　[0040] 色谱柱,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,色谱柱粒径为3.5μm,色谱柱长度为150mm,色谱柱内径为4.6mm。

　　[0052] 供试品溶液色谱图中的杂质峰,按照按面积归一化法计算计算中间体Ⅱ中各已知杂质和未知杂质的含量。

　　[0053] 综上所述,本发明请求保护的分析方法具有如下的积极效果,所述的分析方法可以有明显效果地分离艾曲泊帕中间体及其相关杂质体系,具有专属性好、灵敏度较高、操作便捷、分析时间适中等诸多优点,依据质量源于设计的理念(QBD)从合成路线上游对杂质谱进行了准确监控,使后续杂质传递规律及工艺参数优化研究更方便快捷,为艾曲波帕终产品的质量控制提供了有效保障。

　　[0054] 本发明第三方面提供一种的新的杂质对照品化合物DH,并提供一种制备该杂质化合物DH的方法,该方法有以下步骤,

　　[0056] (1)将SM1、乙酰乙酸乙酯、亚硫酸氢钠溶解在乙醇、纯化水中,搅拌升温至回流,反应2,4小时,

　　[0060] 其中,步骤(1)中SM1、乙酰乙酸乙酯、与亚硫酸氢钠的质量比为1 :0.8: 1 .2,SM1与乙醇的质量体积比为1 :4,SM1与纯化水的质量体积比为1 :4。

　　[0063] 下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解为,本发明的实施例仅仅是用于说明本发明,而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得到的技术方案均属于本发明的保护范围。

　　[0064] 本发明所使用的试剂或原料均能够最终靠现有文献或现存技术制备得到,或者购买得到。

　　[0076] 杂质定位溶液,取中间体Ⅰ、杂质AL、杂质BL、杂质CL、杂质SQ、杂质YW、杂质BD、杂质LS、杂质QA各适量,精密称定,分别置不同的量瓶中,用甲醇溶解并稀释制成每1ml甲醇溶液中约含中间体Ⅰ及各杂质分别为0.2mg的溶液。

　　[0077] 系统适用性溶液,精密量取上述杂质定位溶液各适量,置同一量瓶中,加甲醇稀释制成每1ml甲醇溶液中含中间体Ⅰ及各杂质分别为0.02mg的混合溶液。

　　[0078] 上述溶液按照本发明实施例所述色谱条件检测,杂质定位溶液及系统适用性溶液

　　中各杂质的保留时间和分离度见表3,系统适用性图谱如图1所示。根据结果得出,各杂质与主峰间以及各杂质峰之间分离度均大于1 .5,主峰及各杂质峰的纯度角均小于纯度阈值。因此,系统适用性符合要求。

　　[0082] 基线噪音的测定,精密量取甲醇10μl,注入液相色谱仪,连续进样3针,按照本发明实施例所述色谱条件检测。记录中间体Ⅰ及各杂质出峰时间范围内空白基线噪音,并计算平均值。

　　[0083] 定量限溶液的制备,取中间体Ⅰ、杂质AL、杂质BL、杂质CL、杂质SQ、杂质YW、杂质BD、杂质LS、杂质QA各适量,精密称定,置同一量瓶中,用甲醇溶解并逐步稀释,按照本发明实施例所述色谱条件检测,直至稀释至中间体Ⅰ及各杂质峰高与相应噪音的比值(即信噪比,S/

　　N)约为10为止,此时样品浓度与供试品测定浓度的比值即为定量限,以该浓度连续进样6针,计算峰高平均值。

　　[0084] 试验根据结果得出,在本发明所述分析方法下,各杂质的定量限均在0.05,以下,即供试品中含量在0.05,以上的各已知杂质和未知杂质均可被检测到并准确定量。因此,方法的灵敏度符合要求。

　　[0088] 供试品溶液,取中间体Ⅰ适量,精密称定,用甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含中间体Ⅰ0.2mg的溶液。

　　[0089] 上述溶液于室温条件下放置,分别在0小时、1小时、2小时、5小时、8小时、13小时,精密量取10μl注入液相色谱仪,按照本发明实施例所述色谱条件检测。计算已知杂质、未知杂质和总杂质的变化率,结果见表5。

　　[0090] 试验根据结果得出,中间体Ⅰ测定溶液在室温条件下,杂质YW和总杂质有微弱增加趋势,在5小时内总杂质变化率为0.02,,小于各国药典标准和ICH的一般可接受的忽略阈值

　　0.05,,因而中间体Ⅰ溶液在室温条件下5小时内稳定,即溶液配制后应在5小时内进行测定。

　　[0105] 杂质定位溶液,取中间体Ⅱ、杂质SM1、杂质FJ、杂质DH各适量,精密称定,分别置不同的量瓶中,用甲醇溶解并稀释制成每1ml甲醇溶液中约含中间体Ⅱ及各杂质分别为

　　[0106] 系统适用性溶液,精密量取上述杂质定位溶液各适量,置同一量瓶中,加甲醇稀释制成每1ml甲醇溶液中含中间体Ⅱ及各杂质分别为0.05mg的混合溶液。

　　[0107] 上述溶液按照本发明实施例所述色谱条件检测,杂质定位溶液及系统适用性溶液中各杂质的保留时间和分离度见表6,系统适用性图谱如图2所示。根据结果得出,各杂质与主峰间以及各杂质峰之间分离度均大于1 .5,主峰及各杂质峰的纯度角均小于纯度阈值。因此,系统适用性符合要求。

　　[01 1 1] 基线噪音的测定,精密量取甲醇10μl,注入液相色谱仪,连续进样3针,按照本发明实施例所述色谱条件检测。记录中间体Ⅱ及各杂质出峰时间范围内空白基线噪音,并计算平均值。

　　[01 12] 定量限溶液的制备,取中间体Ⅱ、杂质SM1、杂质FJ、杂质DH各适量,精密称定,置同一量瓶中,用甲醇溶解并逐步稀释,按照本发明实施例所述色谱条件检测,直至稀释至中间体Ⅰ及各杂质峰高与相应噪音的比值(即信噪比,S/N)约为10为止,此时样品浓度与供试品测定浓度的比值即为定量限,以该浓度连续进样6针,计算峰高平均值。

　　[01 13] 试验根据结果得出,在本发明所述分析方法下,各杂质的定量限均在0.02,以下,即供试品中含量0.02,以上的各已知杂质和未知杂质均可被检测到并准确定量。因此,方法的灵敏度符合要求。

　　[01 17] 供试品溶液,取中间体Ⅱ适量,精密称定,用甲醇溶解并稀释制成每1ml甲醇溶液中约含中间体Ⅰ0.5mg的溶液。

　　[01 18] 上述溶液在4℃条件下,分别在0小时、1小时、2小时、5小时、8小时、13小时,精密量取10μl注入液相色谱仪,按照本发明实施例所述色谱条件检测。计算已知杂质、未知杂质和总杂质的变化率,结果见表8。

　　[01 19] 试验根据结果得出,中间体Ⅱ测定溶液在4℃条件下,放置12小时,总杂质变化率小于

　　0.02,,低于各国药典标准和ICH的一般可接受的忽略阈值0.05,,因而中间体Ⅱ溶液在4℃条件下12小时内稳定。

　　[0125] 将3.0g化合物SM1、2.4g化合物乙酰乙酸乙酯、3.6g亚硫酸氢钠溶解在12mL乙醇、12ml纯化水中,搅拌升温至回流,反应3小时,反应完毕,降温至40℃,搅拌1小时,降温至25℃,保温析晶5小时,抽滤,滤液蒸干,经柱层析分离,得杂质DH 1 . 1g。