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　　本发明提供一种氢溴酸伏硫西汀有关物质的检测的新方法,所述液相色谱检验测试条件为,苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,流动相A为磷酸二氢钾溶液和甲醇的混合溶液,流动相B为磷酸二氢钾溶液和甲醇的混合溶液,检测波长为224‑228nm,采用梯度方式洗脱。本发明检测出的杂质多,能快速、有效、准确监控氢溴酸沃替西汀中的有关物质,本发明专属性高,灵敏度较高,回收率高,通过外标法对杂质进行定量分析,增加本发明有关物质检测的准确性。

　　1.一种氢溴酸伏硫西汀有关物质的检测的新方法,其特征是,采用高效液相色谱条件进行仔细的检测,其中所述高效液相色谱测定条件为,以苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,以磷酸缓冲液和甲醇的混合溶液为流动相A,以磷酸缓冲液和甲醇的混合溶液为流动相B,进行梯度洗脱。

　　3.根据权利要求1所述的检测的新方法,其特征是,所述流动相A的磷酸缓冲液选自磷酸二氢钾溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢铵溶液,优选为磷酸二氢钾溶液,所述流动相B的磷酸缓冲液选自磷酸二氢钾溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢铵溶液,优选为磷酸二氢钾溶液。

　　4.根据权利要求1所述的检测的新方法,其特征是,所述流动相A的磷酸二氢钾溶液中磷酸浓度为0.005,‑0.02,,优选为0.02,,所述流动相A的磷酸二氢钾溶液与甲醇体积比为

　　45:55‑60:40,优选为50:50,所述流动相A为含(0.02‑0.03)mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液,优选为为含0.03mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液。

　　5.根据权利要求1所述的检测的新方法,其特征是,所述流动相B的磷酸二氢钾溶液中磷酸浓度为0.015,‑0.02,,优选为0.02,,所述流动相B的磷酸二氢钾溶液和甲醇体积比为

　　5:95‑15:85,优选为10:90,所述流动相B为含(0.02‑0.03)mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液,优选为为含0.03mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液。

　　6.根据权利要求1所述的检测的新方法,其特征是,所述高效液相色谱柱检测波长为(224‑228)nm,优选为226nm。

　　7.根据权利要求1所述的检测的新方法,其特征是,所述高效液相色谱测定条件柱温为30‑45℃,优选为40℃,所述高效液相色谱测定条件流速(0.9,1.1)ml/min,优选为1.0ml/min,所述色谱柱规格为250×4.6mm,3.5μm。

　　8.根据权利要求1所述的检测的新方法,其特征是,所述供试品溶液为含有0.8mg/ml的伏硫西汀上清液。

　　1)供试品溶液制备,取氢溴酸伏硫西汀适量,置量瓶中,加入稀释剂适量,超声处理30分钟,放冷,用稀释剂制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg的溶液,离心,取上清液作为供试品溶液,

　　2)含量检测,取供试品溶液注入液相色谱柱,进行仔细的检测,其中色谱条件为,色谱柱,五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂(WatersXSelectHSSPFP250mm×4.6mm,3.5μm色谱柱或效能相当的色谱柱),以含0.02,磷酸0.03mol/L磷酸二氢钾溶液‑甲醇(50,50)为流动相A,以含0.02,磷酸0.03mol/L磷酸二氢钾溶液‑甲醇(10,90)为流动相B,检测波长226nm,柱温为40℃,按下表梯度洗脱,

　　[0001]本发明涉及化学药物分析方法技术领域,尤其涉及一种氢溴酸伏硫西汀中有关物质的分析方法。

　　[0004]伏硫西汀是由武田制药公司和灵北制药公司联合研制开发,于2013年9月30日经美国食品与药物管理局(FDA)批准在美国上市,商品名为规格分别为5mg、10mg、15mg和20mg。用来医治成人重度抑郁症。伏硫西汀属于新一代抗抑郁药,被开发用于重度抑郁症患者的治疗。该药被认为通过两种作用机制的联合发挥作用,受体活性调节和再摄取抑制。体外研究表明,伏硫西汀是5‑HT3和5‑HT7受体拮抗剂、5‑HT1B受体部分激动剂、5‑HT1A受体激动剂、5‑羟色胺转运蛋白(SERT)抑制剂。体内非临床研究表明,伏硫西汀能增强大脑特定区域神经递质‑血清素、去甲肾上腺素、多巴胺、乙酰胆碱、组胺的水平。伏硫西汀的多模式作用属性,有望能够为那些使用现有药物未能充分控制的重度抑郁症患者带来临床益处。据EvaluatePharma预测,2019年伏硫西汀的销售额将达到8.5亿美元,有很好的市场前景。

　　[0005]为了能够更好的保证药物的安全有效,需要对药物中的有关物质进行研究、检测和监控。有关物质是指在原料药生产中带入的起始物料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质,也可能是制剂在生产、储藏和运送过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。有关物质的种类与药物的合成路线和生产的基本工艺紧密关联,不同的合成路线和生产的基本工艺,药品的杂质谱也会发生明显的变化,因此就需要根据不同的合成路线和生产的基本工艺建立合适的分析方法,达到对氢溴酸伏硫西汀有关物质准确、有效的检测和监控。

　　[0006]本发明提出了一种氢溴酸伏硫西汀中有关物质的分析方法,本发明检测出的杂质多,能快速、有效、准确监控氢溴酸伏硫西汀中的有关物质,本发明灵敏度较高,回收率高,通过外标法对杂质进行定量分析,增加本发明有关物质检测的准确性。

　　[0007]本发明提出的一种氢溴酸伏硫西汀中有关物质的分析方法,采用高效液相色谱法,其色谱条件包括,色谱柱为以苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,以磷酸二氢钾溶液

　　和甲醇的混合溶液为流动相A,以磷酸二氢钾溶液和甲醇的混合溶液为流动相B,检测波长为224‑228nm,进行梯度洗脱。

　　[0008] 本发明所提供的氢溴酸伏硫西汀有关物质的检测的新方法,其中所述梯度洗脱程序为,

　　[0010] 本发明所提供的氢溴酸伏硫西汀有关物质的检测的新方法,其中所述高效液相色谱条件中,流动相A为含(0.02‑0.03)mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液,流动相B为含

　　(0.02‑0.03)mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液,流动相A磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比为45:55‑60:40,流动相B磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比为5:95‑15:85,流动相A中磷酸二氢钾溶液含有0.005‑0.02,的磷酸,流动相B中磷酸二氢钾溶液含有0.015‑0.02,的磷酸。

　　[001 1] 优选流动相A为含0.03mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液,流动相B为含

　　0.03mol/L磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液,流动相A磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比为

　　50:50,流动相B磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比为10:90,流动相A中磷酸二氢钾溶液含有

　　[0015] 本发明所提供的液相色谱条件中,色谱柱规格为,柱长介于150mm至300mm,色谱柱内径介于1 mm至10mm,粒径介于3μm至5μm,色谱柱规格优选为250mm×4.6mm,3.5μm。

　　[0016] 本发明所提供的氢溴酸伏硫西汀有关物质检测的新方法中的有关物质为,

　　[0019] 上述杂质中,杂质A、杂质D、杂质E、杂质P、杂质H和杂质T为工艺杂质,杂质B、杂质Q 和杂质S为降解杂质。

　　[0020] 本发明进一步提供一种氢溴酸伏硫西汀有关物质的检测的新方法,包含以下步骤,

　　[0021] 供试品制备,取氢溴酸伏硫西汀适量,置量瓶中,加入稀释剂适量,超声处理30分钟,放冷,用稀释剂制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg的溶液,离心,取上清液作为供试品溶液。

　　[0022] 对照溶液,精密量取供试品溶液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀4μg 的溶液,作为对照溶液。

　　[0025] 本发明检测出的杂质多,能快速、有效、准确监控氢溴酸伏硫西汀中的有关物质,各杂质峰之间、氢溴酸伏硫西汀主峰及其相邻杂质峰之间的分离度均大于1 .5,峰纯度较好,杂质和主峰可以轻松又有效分离,本发明检测限、定量限均较小,本发明的灵敏度较高,回收率高,可以准确测量氢溴酸伏硫西汀中的有关物质,增加本发明有关物质检测的准确性。

　　[0029] 图4为对比实施例4中样品溶液的HPLC色谱图及强制降解HPLC色谱图

　　[0033] 本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明,并不能用于限制本发明的保护范围。

　　[0043] 精密称取杂质A、H、T、E、D、P、B、Q、S对照品各适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml含各杂质0. 1mg的杂质混合贮备液,精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品适量,再加入杂质混合贮备液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg、含各杂质2μg的混合对照品溶液,作为系统适用性溶液。

　　[0049] 按照上述条件进行高效液相色谱检测,结果如图1所示及下表所示。从图1及表4能够准确的看出,基线上升幅度较大,且杂质A与杂质B完全重合,杂质D、E、P不能与主峰分离。

　　[0054] 1、系统适用性溶液制备,精密称取杂质A、H、T、E、D、P、B、Q、S对照品各适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml含各杂质0. 1mg的杂质混合贮备液,精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品适量,再加入杂质混合贮备液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg、含各杂质2μg的混合对照品溶液,作为系统适用性溶液。

　　[0060] 按照上述条件进行高效液相色谱检测,结果如图2所示及下表所示。从图2及表6能够准确的看出,杂质T与氢溴酸伏硫西汀无法完全分离。

　　[0065] 1、系统适用性溶液制备,精密称取杂质A、H、T、E、D、P、B、Q、S对照品各适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml含各杂质0. 1mg的杂质混合贮备液,精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品适量,再加入杂质混合贮备液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg、含各杂质2μg的混合对照品溶液,作为系统适用性溶液。

　　[0071] 按照上述条件进行高效液相色谱检测,结果如图3所示及下表所示。从图3及表8能够准确的看出,基线起伏异常,杂质T响应较低难以检出。另外,杂质D与杂质Q完全重合,未能分离。

　　[0076] 1、系统适用性溶液制备,精密称取杂质A、H、T、E、D、P、B、Q、S对照品各适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml含各杂质0. 1mg的杂质混合贮备液,精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品适量,再加入杂质混合贮备液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg、含各杂质

　　[0083] 按照上述条件进行高效液相色谱检测,结果如图4所示及表10所示。从图中及下表能够准确的看出,仅有8个峰,不但未检测出杂质Q及杂质S,而且杂质E与主峰未能完全基线分离,分离度不满足要求。

　　[0088] 1、系统适用性溶液制备,精密称取杂质A、H、T、E、D、P、B、Q、S对照品各适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml含各杂质0. 1mg的杂质混合贮备液,精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品适量,再加入杂质混合贮备液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg、含各杂质2μg的混合对照品溶液,作为系统适用性溶液。

　　[0094] 按照上述条件进行高效液相色谱检测,结果如图5所示及表12所示。从图中及表12能够准确的看出,杂质Q(30.790min)与一未知降解杂质完全重合,通过降解杂质峰光谱图与杂质Q 光谱图对比确认为不同的杂质。

　　[0099] 1、系统适用性溶液制备,精密称取杂质A、H、T、E、D、P、B、Q、S对照品各适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml含各杂质0. 1mg的杂质混合贮备液,精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品适量,再加入杂质混合贮备液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg、含各杂质2μg的混合对照品溶液,作为系统适用性溶液。

　　[0101] 用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm,3.5μm) ,以磷酸二氢钾溶液水溶液和甲醇的混合溶液为流动相A,以磷酸二氢钾溶液和甲醇为流动相B,按照如表13所示的梯度洗脱条件进行洗脱,流速为每分钟1 .0ml,检测波长226nm,柱温为40℃.

　　[0141] 1、系统适用性溶液制备,精密称取杂质A、H、T、E、D、P、B、Q、S对照品各适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml含各杂质0. 1mg的杂质混合贮备液,精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品适量,再加入杂质混合贮备液适量,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg、含各杂质2μg的混合对照品溶液,作为系统适用性溶液。

　　[0148] 按照上述条件进行高效液相色谱检测,结果如图6所示及表25所示。从图中及表26能够准确的看出,检测基线平稳,主峰与相邻杂质分离较好,不但可同时分离10个杂质,而且杂质Q 与未知降解杂质(39.207min)分离度达到1 .2,且各杂质响应较好,方法灵敏度高。

　　[0154] 检测限溶液制备,精密称取杂质A对照品适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml约含

　　0. 1mg的杂质A贮备液,同法配制杂质H、T、E、D、P、B、Q、S的各杂质贮备液。精密量取各杂质贮备液适量,用稀释剂制成每1ml约含各杂质0.5μg混合杂质对照品溶液。检测混合杂质对照品溶液,根据其中各杂质峰的信噪比,逐步稀释制成各杂质信噪比约为3时的溶液,即为检测限溶液。

　　[0155] 供试品‑1制备,取氢溴酸伏硫西汀片4片,置合适量瓶中,加入适量稀释剂,超声处理30分钟,放冷,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg的溶液,作为供试品溶液。对照品溶液,精密称取杂质B、Q、S对照品适量,用甲醇溶解并稀释制成每1ml约含各杂质0. 1mg 的对照品贮备液,再用稀释剂稀释制成每1ml约含各杂质4μg的溶液,作为对照品溶液。

　　[0156] 供试品‑2制备,取氢溴酸伏硫西汀片4片,置合适量瓶中,加入上述杂质对照品贮备液适量,再加入适量稀释剂,超声处理30分钟,放冷,用稀释剂稀释制成每1ml约含伏硫西汀0.8mg的溶液,作为供试品溶液2。