本发明属于原料药化学分析技术领域，具体涉及一种分离测定间硝基苯甲醛中相关杂质的方法。所描述的方法包括：以苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以六氟磷酸钾溶液和乙腈作为流动相进行洗脱；所述六氟磷酸钾溶液于所述乙腈的体积比为65‑75：25‑35。该方法选择在流动相中加入六氟磷酸钾以增加杂质的保留，最高会在10min内将4种杂质进行分离，而且检测限、耐用性等均符合检测要求。

  (19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 116359404 A (43)申请公布日 2023.06.30 (21)申请号 6.8 (22)申请日 2021.12.27 (71)申请人 重庆华邦制药有限公司 地址 401121 重庆市渝北区人和星光大道 69号 (72)发明人 穆建飞陈雯陈丽娜周书荣 唐舒棠刘阔 (74)专利代理机构 北京元本知识产权代理事务 所(普通合伙) 11308 专利代理师 黎昌莉 (51)Int.Cl. G01N 30/06 (2006.01) G01N 30/74 (2006.01) 权利要求书2页 说明书10页 附图16页 (54)发明名称 一种分离测定间硝基苯甲醛中相关杂质的 方法 (57)摘要 本发明属于原料药化学分析技术领域，具体 涉及一种分离测定间硝基苯甲醛中相关杂质的 方法。所述方法有 ：以苯基硅烷键合硅胶为填 充剂的色谱柱，以六氟磷酸钾溶液和乙腈作为流 动相进行洗脱；所述六氟磷酸钾溶液于所述乙腈 的体积比为65‑75：25‑35。该方法选择在流动相 中加入六氟磷酸钾以增加杂质的保留，最高会在 10min内将4种杂质进行分离，而且检测限、耐用 性等均符合检测要求。 A 4 0 4 9 5 3 6 1 1 N C CN 116359404 A 权利要求书 1/2页 1.分离间硝基苯甲醛中相关杂质的方法，其特征在于，所述相关杂质为杂质SM 、杂质 1h SM 、杂质SM 、杂质SM 中的一种或多种，所述杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 的结构 1f 1d 1j 1h 1f 1d 1j 式如下所示： 所描述的方法包括：以苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以六氟磷酸钾溶液和乙腈作 为流动相进行洗脱；所述六氟磷酸钾溶液于所述乙腈的体积比为65‑75：25‑35。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.095‑ 0.105M。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述六氟磷酸钾溶液的pH为2.5‑3。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进样流速为0.8‑1.2ml/min。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的温度设置为35‑45℃。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进样样品使用乙腈和水的混合液溶解，所 述乙腈和水的体积比为15‑25:75‑85。 7.测定间硝基苯甲醛及其相关杂质的方法，其特征在于，所述方法有：(1)先使用权 利要求1‑7任一所述的方法对间硝基苯甲醛中相关杂质进行分离；(2)进入检测器进行检 测。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测器的波长设置为230‑260nm。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，停留时间为5.368±0.5min的，测定为杂质 SM ；停留时间为7.303±0.5min的，测定为杂质SM ；停留时间为8.633±0.5min的，测定为 1h 1f 杂质SM ；停留时间为9.137±0.5min的，测定为杂质SM 。 1d 1j 10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据检测器检测得到的峰面积使用外标 2 2 CN 116359404 A 权利要求书 2/2页 法检测对间硝基苯甲醛中相关杂质的含量，计算杂质SM 、杂质SM 或杂质SM 的含量时，所 1h 1f 1d 述检测器的波长设置为230nm；计算杂质SM 的含量时，所述检测器的波长设置为260nm。 1j 3 3 CN 116359404 A 说明书 1/10页 一种分离测定间硝基苯甲醛中相关杂质的方法 技术领域 [0001] 本发明属于原料药化学分析技术领域，具体涉及一种分离测定间硝基苯甲醛中相 关杂质的方法。 背景技术 [0002] 间硝基苯甲醛(3‑硝基苯甲醛)，英文化学名：3‑Nitrobenzaldehyde，分子式为 CHNO ，分子量151.12，其结构式如下所示： 7 5 3 [0003] 间硝基苯甲醛在制药工业中可以用于合成碘普酸钙、碘番酸、间羟胺重酒石酸盐、 尼莫地平、尼卡地平、尼群地平、尼鲁地平碘、普酸钙、碘番酸、胆影脒钙、间羟基重酒石酸、 硝苯苄啶等。间硝基苯甲醛在制备过程中会存在很多杂质，尤其是杂质SM (邻硝基苯甲 1h 酸)、杂质SM (苯甲酸)、杂质SM (间硝基苯甲酸)、杂质SM (对硝基苯甲酸)会影响后期制 1f 1d 1j 备的药品的质量，需要及时监控这些杂质在间硝基苯甲醛的含量达到监控硝基苯甲醛的质 量的目的。间硝基苯甲醛(SM)、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 的名称结构式如下表 1 1h 1f 1d 1j 1所示。 表1 SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 的名称和结构式 1 1h 1f 1d 1j [0004] 目前没有相关文献披露间分离及鉴定硝基苯甲醛中杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、 1h 1f 1d 杂质SM 的方法。 1j 发明内容 [0005] 有鉴于此，本发明目的在于提供一种分离间硝基苯甲醛中相关杂质(杂质SM 、杂 1h 质SM 、杂质SM 、杂质SM )的方法，该方法最快可以在10min内将间硝基苯甲醛中相关杂质 1f 1d 1j 进行分离，分离度高。 4 4 CN 116359404 A 说明书 2/10页 [0006] 所述相关杂质为杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 中的一种或多种，所述杂质 1h 1f 1d 1j SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 的结构式如下所示： 1h 1f 1d 1j [0007] 所述方法包括：以苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以六氟磷酸钾溶液和乙 腈作为流动相进行洗脱；所述六氟磷酸钾溶液于所述乙腈的体积比为65‑75：25‑35。 [0008] 具体的，杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 为小分子的位置异构体，方法采用 1h 1f 1d 1j 对苯环取代位置异构体有特殊选择且有较好保留的的苯基‑己基柱进行分离。 [0009] 优选地，所述六氟磷酸钾溶液于所述乙腈的体积比为70：30。 [0010] 进一步，所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.095‑0.105M，优选为0.1M。 [0011] 进一步，所述六氟磷酸钾溶液的pH为2.5‑3，优选为2.8。 [0012] 进一步，进样流速为0.8‑1.2ml/min，优选为1ml/min。 [0013] 进一步，所述色谱柱的温度设置为35‑45℃，优选为40℃。 [0014] 进一步，进样样品使用乙腈和水的混合液溶解，所述乙腈和水的体积比为15‑25: 75‑85，优选为20：80。 [0015] 本发明目的在于进一步提供一种测定间硝基苯甲醛中相关杂质的方法，所述方法 包括：(1)先使用前任一所述的方法对间硝基苯甲醛中相关杂质进行分离；(2)进入检测器 进行检测。 [0016] 进一步，所述检测器的波长设置为230‑260nm。 [0017] 进一步，停留时间为5.368±0.5min的，测定为杂质SM ；停留时间为7.303± 1h 0.5min的，测定为杂质SM ；停留时间为8.633±0.5min的，测定为杂质SM ；停留时间为 1f 1d 5 5 CN 116359404 A 说明书 3/10页 9.137±0.5min的，测定为杂质SM 1j。 [0018] 进一步，根据检测器检测得到的峰面积使用外标法检测对间硝基苯甲醛中相关杂 质的含量。 [0019] 优选地，计算杂质SM 、杂质SM 或杂质SM 的含量时，所述检测器的波长设置为 1h 1f 1d 230nm；计算杂质SM 的含量时，所述检测器的波长设置为260nm。 1j 本发明有益效果在于 [0020] 本发明提供的分离测定间硝基苯甲醛中相关杂质的方法使用普通反相流动相洗 脱保留很差，本方法选择在流动相中加入六氟磷酸钾以增加杂质的保留，最高会在10min内 将4种杂质进行分离，而且检测限、耐用性等均符合检验测试要求。 附图说明 [0021] 图1为对照品检测波长230nm的测试图谱。 [0022] 图2为对照品检测波长260nm的测试图谱。 [0023] 图3为供试品检测波长230nm的测试图谱。 [0024] 图4为供试品检测波长260nm的测试图谱。 [0025] 图5为空白溶剂检测波长230nm的测试图谱。 [0026] 图6为空白溶剂检测波长260nm的测试图谱。 [0027] 图7为混合溶液检测波长230nm的专属性测试图谱。 [0028] 图8为混合溶液检测波长260nm的专属性测试图谱。 [0029] 图9为检测波长230nm的检测限色谱图。 [0030] 图10为检测波长260nm的检测限色谱图。 [0031] 图11为正常条件检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0032] 图12为正常条件检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0033] 图13为流速(0.9ml/min)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0034] 图14为流速(0.9ml/min)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0035] 图15为流速(1.1ml/min)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0036] 图16为流速(1.1ml/min)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0037] 图17为柱温(38℃)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0038] 图18为柱温(38℃)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0039] 图19为柱温(42℃)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0040] 图20为柱温(42℃)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0041] 图21为六氟磷酸钾pH(2.7)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0042] 图22为六氟磷酸钾pH(2.7)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0043] 图23为六氟磷酸钾pH(2.9)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0044] 图24为六氟磷酸钾pH(2.9)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0045] 图25为流动相比例(29％)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0046] 图26为流动相比例(29％)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0047] 图27为流动相比例(31％)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0048] 图28为流动相比例(31％)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 6 6 CN 116359404 A 说明书 4/10页 [0049] 图29为六氟磷酸钾浓度(0.095M)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0050] 图30为六氟磷酸钾浓度(0.095M)检测波长260nm的耐用性测试图谱。 [0051] 图31为六氟磷酸钾浓度(0.105M)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 [0052] 图32为六氟磷酸钾浓度(0.105M)检测波长230nm的耐用性测试图谱。 具体实施方式 [0053] 所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所 举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和 调整，仍属于本发明的保护范围。 [0054] 本发明实施例中，色谱条件如下表2所示。 表2本发明实施例中色谱条件 [0055] 本发明实施例中，在专属性测试实施例中，由于硝基苯甲醛中还存在一些其他干 扰杂质(杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM )可能干扰检测，所以需要测试其他杂质是否 1h 1f 1d 1j 会干扰。其中，其他干扰杂质名称和结构式如下表3所示。 表3干扰杂质名称和结构式 7 7 CN 116359404 A 说明书 5/10页 [0056] 本发明实施例中，空白溶剂为乙腈‑水(体积比为20:80)。 [0057] 本发明实施例中，对照品溶液配制为：取杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 对 1h 1f 1d 1j 照品适量，精密称定，加溶剂溶解制成每1ml中各含0.18μg、1.5μg、1.5μg、0.18μg的溶液。 [0058] 本发明实施例中，储备液的配制为：分别精密称取杂质SM 对照品25.31mg、SM 对 1h 1f 照品25.54mg、SM 对照品25.83mg、SM 对照品25.00mg，置4个不同的50ml量瓶中，加乙腈溶 1d 1j 解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 、杂质SM 储备液；分别精密称取 1h 1f 1d 1j SM 对照品25.45mg、SM 对照品25.97mg、SM 对照品25.38mg、SM 对照品25.63mg、SM 对照 1a 1b 1c 1e 1g 品25.54mg、SM 对照品25.74mg、SM 对照品25.76mg、SM 对照品25.35mg，置8个25ml量瓶 1i 1k 1l 中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各杂质及主成分储备液。 [0059] 本发明实施例中，混合储备液1#的配制为：精密移取杂质SM 和SM 储备液各 1f 1d 5.0ml，SM 和SM 储备液各0.6ml，置同一50ml量瓶中，加乙腈‑水(20:80)稀释至刻度，摇 1h 1j 匀，即得。 [0060] 本发明实施例中，混合储备液2#的配制为：精密移取SM 、SM 、SM 储备液各 1a 1c 1g 1.3ml，SM 储备液2.5ml，SM 、SM 、SM 、SM 储备液各0.2ml，置同一25ml量瓶中，加乙腈‑ 1b 1i 1e 1k 1l 水(20:80)稀释至刻度，摇匀，即得。 [0061] 本发明实施例中，定位溶液的配制为：精密移取SM 、SM 、SM 、SM 、SM 、SM 、 1h 1f 1d 1j 1a 1b SM 、SM 、SM 、SM 、SM 、SM 储备液各0.1ml，置12个不同的10ml量瓶中，加乙腈‑水(20: 1c 1e 1g 1i 1k 1l 80)稀释至刻度，摇匀，即得。 [0062] 本发明实施例中，供试品溶液的配制为：精密称取SM (210126批)51.18mg，置50ml 1 量瓶中，加乙腈‑水(20:80)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 [0063] 本发明实施中，混合溶液的配制为：精密称取SM (210126批)50.34mg，置50ml量瓶 1 8 8 CN 116359404 A 说明书 6/10页 中，再精密移取混合储备液1#和混合储备液2#各1.5ml加入，加乙腈‑水(20:80)溶解并稀释 至刻度，摇匀，即得。 [0064] 本发明实施例中，检测限溶液的配制为：精密移取定量限储备液1#0.1ml、定量限 储备液1#0.4ml，置50ml量瓶中，加乙腈‑水(20:80)稀释至刻度，摇匀；精密移取该溶液 3.3ml，置10ml量瓶中，加乙腈‑水(20:80)稀释至刻度，摇匀，即得。 [0065] 本发明实施例中，定量限储备液1#的配制为：精密移取SM 和SM 储备液各5.0ml， 1d 1f 置50ml量瓶中，加乙腈‑水(20:80)稀释至刻度，摇匀；精密移取2.0ml，置10ml量瓶中，加乙 腈‑水(20:80)稀释至刻度，摇匀，即得。 [0066] 本发明实施例中，定量限储备液2#的配制为：精密移取SM 和SM 储备液各0.6ml， 1h 1j 置50ml量瓶中，加乙腈‑水(20:80)稀释至刻度，摇匀，即得。 [0067] 本发明实施例中，含量计算为：按外标法以峰面积计算，在230nm波长下计算杂质 SM 、杂质SM 、杂质SM 的含量，在260nm波长下，计算杂质SM 的含量。 1h 1f 1d 1j [0068] 本发明实施例中，使用以下公式进行仔细的检测限测试： [0069] 实施例1样品测试 [0070] (1)精密量取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，检测波长设置230nm 和260nm的检测色谱图如图1和图2所示，其积分结果如表4和表5所示。 表4检测波长设置230nm的对照品溶液积分结果 表5检测波长设置260nm的对照品溶液色谱积分结果 [0071] 对照品溶液色谱图中，在230nm波长下，出峰顺序依次为杂质SM 、杂质SM 、杂质 1h 1f SM 、杂质SM ，各峰间的分离度均应符合标准要求。 1d 1j [0072] (2)精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，检测波长设置230nm 和260nm的检测色谱图如图3和图4所示，其积分结果如表6和表7所示。 表6检测波长设置230nm的供试品溶液积分结果 表7检测波长设置260nm的供试品溶液积分结果 9 9 CN 116359404 A 说明书 7/10页 [0073] (3)按外标法以峰面积计算各杂质的含量，计算结果如下表8所示。 表8各杂质的含量计算结果 [0074] 实施例2专属性测试 [0075] (1)取空白溶剂20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，检测波长设置230nm和260nm 的检测色谱图如图5和图6所示，色谱图表明，空白溶剂不干扰各杂质测定。 [0076] (2)取各定位溶液、供试品溶液和混合溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，其中混 合溶液在检测波长设置230nm和260nm时的检测色谱图分别如图7和图8所示，试验结果见下 表9。 表9方法专属性试验结果 10 10 CN 116359404 A 说明书 8/10页 [0077] 实施例3检测限测定 [0078] 精密量取检测限溶液20μl，连续进样3次，记录色谱图，其中一次进样的检测波长 设置230nm和260nm时的检测色谱图如图9和图10所示，并计算各峰的信噪比，结果见下表 10。 表10检测限试验结果 [0079] 实施例4色谱条件耐用性测试 [0080] 取混合溶液，分别微调各色谱条件进行实验，其中： [0081] 正常条件(表2的色谱条件)下，检测波长设置230nm和260nm的检测色谱图分别如 图11和图12所示； [0082] 0.9ml/min流速(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm和260nm的检测色谱 图分别如图13和图14所示； [0083] 1.1ml/min流速(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm和260nm的检测色谱 图分别如图15和图16所示； [0084] 柱温38℃(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm和260nm的检测色谱图分 别如图17和图18所示； [0085] 柱温42℃(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm和260nm的检测色谱图分 别如图19和图20所示； [0086] 流动相中六氟磷酸钾溶液pH 2.7(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm和 11 11 CN 116359404 A 说明书 9/10页 260nm的检测色谱图分别如图21和图22所示； [0087] 流动相中六氟磷酸钾溶液pH 2.9(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm和 260nm的检测色谱图分别如图23和图24所示； [0088] 流动相体积比例设置为29％(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm和 260nm的检测色谱图分别如图25和图26所示； [0089] 流动相体积比例设置为31％下(其他色谱条件同表2)，检测波长设置230nm和 260nm的检测色谱图分别如图27和图28所示； [0090] 流动相中六氟磷酸钾溶液为0.095M(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm 和260nm的检测色谱图分别如图29和图30所示； [0091] 流动相中六氟磷酸钾溶液为0.105M(其他色谱条件同表2)下，检测波长设置230nm 和260nm的检测色谱图分别如图31和图32所示。 [0092] 根据色谱图考察各峰之间的分离度，检测波长设置230nm和260nm的结果分别如表 11和表12所示。 表11检测波长设置230nm的色谱系统耐用性测定结果 表12检测波长设置230nm的色谱系统耐用性测定结果 12 12 CN 116359404 A 说明书 10/10页 [0093] 需要说明的是，在本发明中，间硝基苯甲醛峰是色谱图中的最大色谱峰，出峰时间 约在12min‑17min。 [0094] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案做修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围。 13 13 CN 116359404 A 说明书附图 1/16页 图1 图2 14 14 CN 116359404 A 说明书附图 2/16页 图3 图4 15 15 CN 116359404 A 说明书附图 3/16页 图5 图6 16 16 CN 116359404 A 说明书附图 4/16页 图7 图8 17 17 CN 116359404 A 说明书附图 5/16页 图9 图10 18 18 CN 116359404 A 说明书附图 6/16页 图11 图12 19 19 CN 116359404 A 说明书附图 7/16页 图13 图14 20 20 CN 116359404 A 说明书附图 8/16页 图15 图16 21 21 CN 116359404 A 说明书附图 9/16页 图17 图18 22 22 CN 116359404 A 说明书附图 10/16页 图19 图20 23 23 CN 116359404 A 说明书附图 11/16页 图21 图22 24 24 CN 116359404 A 说明书附图 12/16页 图23 图24 25 25 CN 116359404 A 说明书附图 13/16页 图25 图26 26 26 CN 116359404 A 说明书附图 14/16页 图27 图28 27 27 CN 116359404 A 说明书附图 15/16页 图29 图30 28 28 CN 116359404 A 说明书附图 16/16页 图31 图32 29 29

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