一直以来，不断有很多用户向我们咨询有关氨基色谱柱使用的一些问题，常常抱怨某些品牌的氨基色谱柱的寿命很短，希望有好的解决方案，或者直接询问我们的JADE-PAK® NH2 色谱柱寿命是否会长一点。因此我们这一期再来讨论一下有关氨基色谱柱的问题。 关于我们的产品：JADE-PAK® NH2 的性能我们很有信心，但关于寿命，想要一支跟C18色谱柱寿命一样长的氨基色谱柱，几乎是不可能的事情！品牌的氨基色谱柱的寿命短，并不是色谱柱本身性能原因。 JADE-PAK® NH2 色谱柱和另外的品牌的氨基色谱柱一样，色谱柱的寿命是跟色谱条件紧密关联的！我们将结合氨基色谱柱固定相的内在结构分析氨基色谱柱柱效迅速下降的原因，然后讨论解决的方案。 JADE-PAK® 氨基硅胶键合相的基本结构： 中文全称：氨基丙基键合硅胶或氨基丙基硅胶键合相。 作用模式：正相模式、反相模式、弱阴离子交换模式和亲水作用色谱模式。 大多数公司的氨基色谱柱出厂保存液都是正相体系，使用不相同模式的时候，首先要注意色谱柱和仪器的过渡问题。关于正相反相系统的过渡，我们已在本系列讲座*讲讨论过了，这里不再复述。 氨基色谱柱寿命下降的缘由分析。 1、 氨基离子化。 氨基键合相，极易吸附氢离子，使固定相带正电，引入额外的阴离子选择性和氢键作用，导致那些带有卤素基团化合物，以及含氧、氮、硫等基团化合物，峰变宽、拖尾，柱效下降： 这种离子化的结果，同时也给氨基固定相带来另外一种应用模式弱阴离子交换模式，对羧基化合物、磺酸基化合物和磷酸酯类化合物有良好的选择性。 按：当分析物为羧基化合物时，如果要利用其离子交换功能，需要把流动相 pH 控制在 6~7 范围。相反，如果羧基化合物想要避免发生这种离子交换作用，则要把流动相 pH 控制在 3 以下。 另外，一旦氨基固定相离子化以后，就很难再*清理洗涤干净，也会导致色谱柱在停机保存期间发生明显的变化，使色谱柱寿命下降。 业内有人推荐用氨水或其他碱性溶液（如 NaOH）“再生”氨基色谱柱，对此方法，我们公司持保留意见，并建议用户谨慎采用。 原理： R-NH2 pKb10，当再生碱性溶液 pH pKb时，平衡向右移动，即[OH-] 0.0001M 但硅胶在pH8 时，会快速溶解，使色谱柱迅速失效！ Phenomenex Luna NH2色谱柱，采取了特殊的“交联”技术，拓宽了 pH 稳定范围（pH 1.5~11），能够尝试使用此方法再生；但这种“交联”结构，也会改变氨基键合相的选择性，可能会产生不同的分离效果。 那是不是有其他办法能够更好地清洗/再生氨基色谱柱呢？很遗憾，目前线、 固定相与分析物发生希夫氏碱反应。 当样品中含有羰基化合物时（醛类和酮类），特别是流动相是酸性环境时，很容易发生希夫氏碱反应，导致色谱柱柱效下降。 这种反应，醛类是要比酮类更容易发生。 由于反应是可逆的，所以，当我们判断色谱柱是因为固定相发生了希夫氏碱反应导致柱效下降后（比如分析糖类的时候，特别是还原糖类），能够尝试用 0.0005M H2SO4-MeCN（90:10）去“再生”，但不幸的是：这个“再生”会同时导致氨基固定相离子化！ 如果样品里含有-羰基芳香族化合物，就不可能再生了，因为这时希夫氏碱反应是不可逆的！ 3、 正相模式使用时吸收了过多的水。 任何正相色谱体系，固定相中如果含有过多的水，都可能会导致色谱柱柱效下降，氨基色谱柱也不例外！一些经验不足的用户经常因为仪器过渡没做好，导致正相模式使用氨基色谱柱非常无谓地接触到水，使色谱柱性能直线下降。如果不幸的事情已发生，可以用以下程序除水： 用含 2.5% 2,2-二甲氧基丙烷和 2.5%冰醋酸正己烷冲洗 10 倍柱体积，再用正己烷清洗30 倍柱体积。 4、 HILIC 模式缺水。 按：有关HILIC 模式的详细介绍，我们将在下一讲详细讨论，敬请关注！ 氨基色谱柱也经常作为 HILIC 色谱柱在使用，尤其是一些早期的法定标准。如果仔细分析目前“反相氨基色谱柱方法”，有很大一部分其实都是 HILIC 模式。与正相模式相反，HILIC （亲水作用色谱）模式固定相需要保持充足的水分，才能确保方法重现性。但氨基色谱柱每次使用后，都需要把盐清理洗涤干净，保存在有机溶剂中；如此一来，每次作为 HILIC 模式使用时，都需要很长的平衡时间。基线平稳并不是色谱柱充分平衡与否的标志，这是很多用户的认识误区，一些用户根据基线情况，着急进样，却发现分离效果并不理想，这是都是因为“水” 的原因。为缩短平衡时间，可以用 100mM 醋酸铵（pH6~7）-乙腈（80:20）运行 10 倍柱体积，帮助氨基色谱柱快速转换到 HILIC 模式。 氨基色谱柱的确是非常“复杂”的色谱柱，影响寿命的因素还有很多，而且使用的过程中还有很多不能避免的操作导致色谱柱性能直线下降很快！我们这里的讨论仅代表一家之言，未必能反映所有氨基色谱柱性能迅速下降的真正原因。但以下八点使用需要注意的几点，务必请氨基色谱柱用户重视： 1、注意不同体系和模式的过渡 2、流动相使用高纯度的试剂，包括缓冲盐和酸碱调节剂；氨基基团活性确实太大了，试剂中的微量杂质都可能会导致色谱柱性能迅速下降 3、确保溶剂互溶，确保缓冲盐*溶解，确保样品能*溶解于流动相 4、醛、酮类化合物可能会导致色谱柱寿命减少，不推荐使用 5、流动相 pH 应用限制范围：2.0~7.5 6、使用温度：60℃ 7、压力范围：3500Psi，避免压力急剧变化 8、流速：根据流动相黏度，依据压力限制设置

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